本文作者：小红猪小分队

 

“以目前的科学水平想要理解人类最基本的神经解剖都很困难。”弗朗西斯·克里克和爱德华·琼斯在“脑的十年”(1990-1999)期间发出这样的悲叹。 在1993的时候他们这样写到，“很显然，研究人类大脑的解剖构造有必要借助于快速发展的新兴技术。” 其他研究者们也都认可这一看法。如今他们正在使用最新的技术和自动化手段对神经元间的连接进行空前细致的、完备的绘制。国立健康研究院(NIH)已经投入了近四千万美元来绘制人类大脑的线路图，艾伦大脑研究院(Allen Brain Institute)也倾注了数百万美元绘制小鼠的脑图谱。编制这些数据需要耗时数年甚至更久，要完全理解它们则是一个更加漫长的历程。虽然前路漫漫，但是研究的结果可能会揭示很多人类个体差异的自然因素。就像麻省理工学院的神经学家承現峻的观点，“你之所以是你，并不只是因为你基因组的特异性，更因为你的连接组(Connectome)与众不同。”

—— 杰弗里 M·帕克勒

 【图片出处：http://coleman.ucsd.edu/】

承現峻在《大脑的连接如何塑造了我们》中这样描述连接组学，“你就是你的连接组。” 他的意思是指神经元间的连接关系就像是指纹一样因人而异。众人都是他们自身的基因组、生活环境以及成长经验等因素的混合产物。这些因素影响了脑内的连接。即使是同卵双胞胎，他们脑内的连接也极有可能是迥然不同的。

通过绘制神经元的连接，研究者希望能了解人类连接组的常规可塑性，以及当人们在学习、成长和老化的过程下，神经元又如何变化并重新塑造它们之间的连接。人们可以从此开始分析大脑连接组是如何在例如脑外伤、神经退行性疾病、精神分裂症或者自闭症中变得功能失调。承現峻将这种失调称之为“连接组病理学”。

然而研究这种非常规尺度的问题着实令人困扰。目前只有一种生物，（秀丽隐杆）线虫的连接组被完整的绘制了出来。这类线虫只包含了300个神经元，彼此间形成了7000对连接。仅仅绘制它的神经元连接就耗费了十年以上的时间。“人类的连接组比线虫的复杂一千亿倍，同时也比人类本身的基因组多了一百万倍。” 承現峻这样写道，“跟连接组学的研究比起来，基因组学真是小菜一碟。”

尽管如此，研究者们还是在试图解决这个问题。从所谓的宏观尺度核磁共振成像，到微尺度的电子显微学，连接组学正在缓慢的以每次一个突触的速度接近问题的核心。

人类连接组计划

“如果想形象的理解什么是连接组学，可以参照谷歌地图。”艾伦大脑研究院的高级研究主任Zeng Hongkui这样比喻。神经科学家称在大脑的虚拟空间中穿梭好比现代人在英特网上旅行一样：可以随心所欲的放大和缩小，从整个脑的不同区域逐步精确到单个神经元甚至突触。“依照这个类比，”Zeng说道，“宏观尺度的核磁共振成像只能显示神经通路中的超大型高速公路。但却非常有用，它可以提供关于大脑组织的全景图，可以直观的显示信息是如何区域化又如何汇总联系在一起的。”

这一设想正是人类连接组学计划的核心。这项投入4千万美金的计划是国立健康研究院于2010年九月发起的，旨在绘制活人的大脑连接。人类连接组学计划资助了两项合作研究。其中三千万的资金提供给华盛顿大学圣路易斯分校（WUSL）与明尼苏达大学（UM）的合作团队，八百五十万的资金提供给马萨诸塞州立综合医院（MGH）和加州大学洛杉矶分校（UCLA）的合作团队。

两支队伍都在寻求技术进步的同时，WUSL/UM队甚至尝试把成果投入实用。他们对400对双胞胎以及他们非孪生的兄弟姐妹共计1200位普通成年人进行了一系列行为的、基因的以及成像的扫描，产生的数据作为参照以便和其他连接组学的数据进行对比。

两个合作团队都使用了核磁共振成像的方法，但方式上有所差异。MUSL/UM队使用核磁共振成像来扫描大脑解剖特征以及功能上的连接方式，比如那些为了完成日常任务而形成的区域连接。而为了绘制连接的物理层面，MGH合作团队使用了漫反射核磁共振成像。这种成像技术可以通过追踪水分子的运动来确定神经元轴突纤维的走向。MGH团队的负责人Van Wedeen为我们解释了这一技术：“相对于水分子垂直于神经纤维的运动，沿着纤维方向的运动速度更快。”

由此，Wedeen发明了一种新式的漫反射核磁共振成像技术。这种新技术被称为漫反射频谱成像(DSI)；而WUSL的队伍使用的成像技术叫做高角度分辨率漫反射成像(HARDI)。两种方法的理念都是将大脑划分成数千个呈立方体的像素格。每个像素格的单位在立方毫米级别，并且可以通过水分子的漫反射来确定它们各自的方向性。然后根据示踪图像法，这些矢量格就可以通过各种标记了不同颜色的线路，或者说神经纤维传导轨迹，连接在一起并且通向大脑的白质。

由此不仅能得到单独某一个的轴突的分布，而是数以千计错综复杂交织在一起的轴突地图。“这些设备产生的数据仅仅是微分方程的数值积分，还达不到纤维的显微成像那样的精度。”Wedeen说 。尽管如此，这些相对很低分辨率的数据收集依然需要配置强大的硬件设施。一个标准的临床用核磁共振机，可以制造出3特斯拉强度的磁场以及以每分钟40毫特斯拉进行梯度变化的磁场。WUSL所使用的是西门子特别制造的仪器，可以产生3特斯拉的磁场并且每分钟变化100毫特斯拉，而MGH/UCLA队使用的“连接组扫描仪”可以每分钟变化300毫特斯拉。

这些强劲的梯度变化磁场对绘制连接图有两方面的好处，Wedeen说，一是数据量很大，二是数据更加精确。这就像使用更大光学反射镜的望远镜可以看到更远的地方。

明尼苏达大学核磁共振中心主任，同时身兼华盛顿大学合作研究首席的Kamil Ugurbil，说他的团队已经通过新的扫描系统取得了巨大进步。这种扫描系统的分辨率提高了两三倍，并且已经扫描过大约三十个主体，每次扫描为期两天。

但是 Ugurbil不再用100毫特拉斯每秒的3特斯拉扫描仪进行研究。这台机器作为该项目的“成果展示”而被运往了华盛顿大学。ugurbil正在使用一台新的西门子7特斯拉仪器进行扫描工作。它能提供更清晰的图像。同时，ugurbil还在等待另外一台10.5特拉斯，价值超过一千万的新设备。目前，这台新设备正在工厂里等待测试，他说，之所以还没有拿到这台机器是因为缺少一种全世界都很短缺的液态氦，要冷却这个巨大的核磁机必须使用4万公升液态氦。

绘制中等尺度的连接

艾伦大脑研究所正在绘制Zeng所称的“中等尺度”的小鼠连接组。这一绘制策略是由冷泉港实验室的神经学家Partha Mitra及同事于2009年提出的。为了创建这种图像，Zeng的团队使用了被称为“序列双光子X射线断层摄像”的方法。

重组腺伴随病毒被注射到小鼠大脑的不同区域。这些病毒可以表达荧光蛋白。将小鼠处死后，把它们的脑在琼脂糖中定型。随后将组织固定在双光子荧光显微镜内，并使用专门设计的超精微切割设备或者振动切片机（TissueVision公司生产）切割。

在这种装置内，通过对组织的上表面以0.35um的横向分辨率来进行荧光显象，通过追踪注入到不同区域的病毒的走向，可以显示出神经元的脉络。然后震动切片机将最上面100um的部分切掉，露出下面的组织，如此一再重复本过程。

“不断的成像，切除，再成像，再切除，” Zeng说道。整个过程是完全自动化的，她进一步解释，完成一次病毒注射后生成大脑的原始图像数据需要大约750GB存储空间，以及大约18小时的时间，而这仅仅是对一个大脑而言。一个完整的数据库由接近五百次不同的注射位置，也就是至少五百个大脑构成。所有这些数据都要整合在一个三维的模板中用于比较、浏览以及生成一个有细节的全脑连接的矩阵模型。

从技术上讲，Zeng说，艾伦大脑研究所并不是在收集“连接组”数据。他们的病毒是不可复制的。这意味着神经元只能被感染一次。并且病毒不能够通过神经元的突触。所以Zeng说她的工作只是在做“投射组”成像。

依照Zeng的说法，已经得到绝大多数大脑的数据，并且其中一些已经向公众发布。（这些数据可以使用Institute’s Brain Explorer软件免费浏览，软件可以通过艾伦连接图谱数据端口自由下载，www.brain-map.org）现在她正在回过头来用病毒重复一些特殊的神经元的亚型连接，比如试图理解兴奋型和抑制性神经元的投射组有何不同。

在冷泉港实验室，Mitra实施了类似的策略。他对每个小鼠大脑中的262个的格子分别都进行注射，不同的是他使用了四种不同的示踪剂–两种顺行性的和两种逆行性的。收集一个这样的数据库大约需要1000只小鼠的脑。

顺行性的示踪剂，比如AAV或者生物素化葡聚糖，渗透进细胞胞体然后按照顺行性转运机制，由胞体沿着轴突向突触末端搬运分子，Mitra这样解释。逆行性的示踪剂，比如霍乱毒素或者狂犬病毒通过突触进入细胞，通过轴突骨架向胞体移动，这样可以完成长距离的连接信息。

Mitra先把每个小鼠的脑用冰冻切片的方式手动切成20微米的节段，每个节段隔40微米，然后用Hamamatsu Nanozoomer 2.0 自动荧光扫描显微镜扫描切片。重构之后的数据库中，每一面的半微米就包含了一兆个立体像素。这些还仅仅是漫反射核磁共振像素的十亿分之一。每个注射位置需要1TB空间，他说，他的实验室已经收集了将近1PB的信息，一部分已经于6月发布。（ www.brainarchitecture.org）

向微尺度进军

中等尺度的信息密度不能真实的展示突触间的连接。“往纯粹点说，我们所绘制的并不是连接本身，”Mitra说，“为了真正的展示那些连接的存在，我必须要向你展示突触以及递质穿过突触的画面。”

很显然中等尺度的成像无法做到这点。但是微尺度成像可以在一定程度上达到要求。在Zeng关于google map的类比中，这种成像就好比观察通往一个个单独居所的车道或者人行道。用以观察这些细节信息的技术是电子显微学。

在哈佛大学，神经学家Jeff 将丘脑分成 400 x 400 x 250 微米，并使用自制的设备将其切成9000个超薄的切片。每一片都贴在一个移动条带的黑色表面上，就好像用老式的电影胶片卷着一些脑切片。然后这些条带被送进一个扫描电子显微镜里，像一台电影放映机一样，一张张的将切片成像。

根据Lichtman的说法，一个节段使用4纳米的分辨率以每张25,000 x 25,000个像素每16张为一组的进行扫描，每秒可以收集20兆像素，这种处理每天产出1TB数据，每天不间断开工的话扫描一枚完整的大脑需要100天。

我们的目标是绘制丘脑中的视网膜神经节的组织结构，他说，我们坚信，视网膜信息中枢处理第一阶段的信息包含在这些数据中。

Lichtman最近又得到了一台新的电子显微镜，所以收集数据的速度比现在快了一倍，每秒可以达到40兆像素。但是即便在这种速度下，在纳米级别的分辨率下绘制一个完整的人脑也是不切实际的，一个立方毫米的数据就占了1000TB，即使每秒40兆像素的速度，再完成另一个立方毫米的成像都要花费数年。

下一代的设备也许可以帮上忙。蔡司开发了一种新的自动化电子显微镜，Lichtman说，这种显微镜每次用61个电子束对节段成像，数据采集速度大约是现在的60倍；他希望能在几年内得到这种设备。

但是采集数据仅仅是战斗的前半部分，来自位于德国Martinsried的马克斯 – 普朗克神经生物学研究所的Moritz Helmstaedter说，数据分析是另一半。

Helmstaedter作为一名博后与Winfried在海德堡马克斯 – 普朗克研究所工作。在那里Helmstaedter使用SBEM（serial blockface electron microscopy）技术对一个脑进行成像、切片的工作，类似于艾伦研究所的工作，但却是在纳米尺度，对一片包含1000个神经元的视网膜组织进行成像。

按照Helmstaedter的说法，SBEM可以连续八个星期工作，收集13000幅图像，每幅包含2.5G像素。然而这项工作耗费了超过两年的时间去重构神经元的连接线路。

Helmstaedter的解决办法借用了“大家一起来”蛋白重叠游戏-Foldit。他的团队利用电脑整合图像以追踪神经突。为了保障准确性，他们以每小时10美元的薪水雇佣了200个大学生，坐在电脑前按照飞行模拟游戏的方式在电脑绘制的突触丛林中穿梭。这些学生帮助证实了差不多900个神经元的视网膜连接组， Helmstaedter说。

现在 Helmstaedter在一片包含10000个神经元的一侧新皮层上下了赌注。他们需要一个更宽泛的蜂房理念(http://en.wikipedia.org/wiki/HiveMind)。他们希望能开发一个目前流行的游戏，使参与者能在移动设备上点击使用。

在连接组学中， Helmstaedter说，网络的重构是瓶颈所在，我们必须采取一些非常规的方式去完成它。

说明

本文中所提及的公司不含AAAS或者Science认证的公司，同时也没有暗示这些公司所提供的产品、服务比其他公司的更优质。